El juego comienza tras los eventos ocurridos en Assassin's Creed: Brotherhood. Desmond se halla en estado de coma y es metido dentro del "Animus" para que su conciencia no se destruya. Despierta dentro de una isla, donde el Sujeto 16 le explica que su mente está dividida en tres partes: la de Altaïr, la de Ezio y la suya, y que solo despertará del coma si termina de ver todas las memorias restantes de Ezio y Altaïr para que el "Animus" no tenga nada más que mostrar y le permita separar los recuerdos. También le hace saber que él, para el "Animus", es un virus que deberá ser eliminado y que 16 hará todo lo posible para mantenerlo activo y que nadie se percate de su presencia. Tras esto, 16 dice qué, si Desmond se da prisa, podrá llegar al funeral de Lucy, revelando así que Lucy murió al final del tercer juego. Desmond entra en Las puertas Negras del "Animus", reviviendo una vez más en las memorias de su antepasado Ezio Auditore, quien se encuentra camino a Masyaf en deseo de cumplir el sueño de su padre: encontrar la biblioteca de Altaïr, el asesino antepasado de Desmond que cambió la historia de los asesinos para siempre. Durante su trayecto, relata todas sus aventuras a su hermana Claudia por medio de cartas.